Udział plazmidów i bakteriofagów w tworzeniu różnorodnych typów serologicznych Salmonella

W kolekcji szczepów własnych, jakie udało się nam wyhodować w laboratorium mikrobiologicznym mamy zgromadzonych ok. 20 szczepów pałeczek Salmonella należących do różnych grup serologicznych. Szczepy wyhodowano z materiału od chorych na schorzenia żołądkowo-jelitowe, osób ze styczności, od nosicieli SS (np. S. Paratyphi B od nosiciela stałego) lub z materiału przesłanego do identyfikacji z innych laboratoriów mikrobiologicznych.

Pałeczki z rodzaju Salmonella liczą ogółem 2557 typów serologicznych, z czego gatunek Salmonella enterica subsp. enterica liczy 1531  typów serologicznych. W ciągu 30 lat mojej pracy udało mi się wykryć, oznaczyć i zgromadzić conajmniej 20 serowarów z różnych grup serologicznych. Każdy z nich (oprócz S. Enteritidis -najczęściej występujący na naszym terenie) został potwierdzony przez laboratorium referencyjne wojewódzkiej stacji, bądź w PZH lub Krajowym Ośrodku Salmonella. 

Serologiczne typy pałeczek z rodzaju Salmonella wyhodowane w latach 1980-2011 w laboratorium PSSE w Leżajsku

Typ serologiczny - Antygen 0: Antygen H Faza 1: Antygen H Faza2
S. Schleissheim – 4,12,27:b

S. Paratyphi B -  1,4,[5],12,27:b:1,2

S. Abony II -  1,4,12,27:b:e,n,x

S. Derby -  1,4,[5],12:f.g:[1,2]

S. Agona -  1,4,12:f,g,s:[1,2]

S. Typhimurium -  1,4,[5],12:i:1,2

S. Lagos -  1,4,[5],12:l:1,5

S. Heidelberg – 1,4,[5],12:r:[1,2]

S. Infantis – 6,7,14:r:1,5

S. Montevideo – 6,7,14:g,m,[p],s:[1,2,7]

S. Oranienburg – 6,7,14:m,t:[z₅₇]

S. Mbandaka – 6,7,14:z₁₀:e,n,z₁₅

S. Virchow – 6,7,14:r:1,2
S. Tennessee – 6,7,14:z29:[1,2,7]

S. Newport – 6,8,20:e,h:1,2:[z₆₇]

S. Hadar – 6,8:z₁₀:e,n,x

S. Enteritidis – 1,9,12:g,m

S. Javiana – 1,9,12:l,z₂₈:1,5

S. Anatum – 3,10[15] [15,34]:e,h:1,6
S. Muenster – 3,10[15] [15,34]:e,h:1,5
Objaśnienia: 
[  ] = antygen 0 lub H, bądź ich składniki mogą nie występować
cyfra podkreślona = składniki 0 antygenu ujawniające się dopiero w następstwie konwersji fagowej, mogą wystepować wtedy, gdy hodowla bakteryjna ulegnie lizogenizacji przez odpowiedniego faga.

Skąd taka różnorodność antygenowa szczepów, wśród jednego tylko podgatunku enterica? Skąd takie egzotycznie brzmiące nazwy serotypów?

W Schemacie White’a-Kauffmanna-Le Minora znalazłam zaledwie jeden nowy serowar wykryty po raz pierwszy w Polsce. Nazwany Salmonella Lodz, zapewne z tego powodu, że został wykryty w Łodzi, bo taka jest konwencja, aby nowo wykryty, dotychczas nieznany szczep nazwać nazwą miejscowości, w której został wykryty.

Mam nadzieję, że uda mi się  kiedyś wyhodować szczep, o całkiem nowym dotychczas jeszcze nieznanym zestawie antygenów, że Instytut Pasteura potwierdzi jego przynależność do Salmonella enterica subsp. enterica, że zostanie on umieszczony w Schemacie White’a-Kauffmanna-Le Minora, dokumencie referencyjnym przeznaczonym do identyfikacji serologicznej bakterii Salmonella, w którym figurować będzie jako serotyp o nazwie Salmonella Lezajsk.

Ewolucja w świecie żywym trwa, więc kto wie, może kiedyś?!

Zmienność w świecie organizmów prokariotycznych jest wynikiem wymiany genetycznej zakodowanej w chromosomach i innych elementach genetycznych, jak plazmidach czy profagach  odgrywa istotną rolę w ewolucji. Pełnią one bardzo ważną rolę w kształtowaniu nowych wariantów tych mikroorganizmów.

Taka wymiana informacji genetycznej zachodzi pomiędzy komórkami nawet odległych filogenetycznie gatunków bakterii.

Na przykład, spośród 173  przebadanych szczepów Salmonella Typhimurium, aż 136 zawierało profagi. Badania prowadzone z  zastosowaniem takich metod jak hybrydyzacja DNA oraz  analiza porównawcza sekwencji DNA genomów Salmonella Typhi i Salmonella Typhimurium wykazały, że to głównie zawartość genów pochodzących z plazmidów typu F i lambdoidalnych fagów decyduje o różnorodności obserwowanej pomiędzy tymi serowarami [1].

O różnorodności między serowarami decydują w dużej mierze geny zlokalizowane na plazmidach typu F i lamdoidalnych fagach.

Plazmid koniugacyjny  F, charakterystyczny dla E. coli, może być przekazywany w  procesie koniugacji z  E. coli do  S. Typhimurium, a także do innych typów serologicznych salmonella. Izolowano szczepy S. Typhimurium, posiadające plazmid F wbudowany do chromosomu; szczepy takie nazywane są, podobnie jak u E. coli, szczepami Hfr (high-frequency of recombination). Istnieje więc możliwość przekazywania z  wysoką częstotliwością genów chromosomowych ze szczepów Hfr S. Typhimurium do szczepów E. coli i odwrotnie. Na przykład geny chromosomowe odpowiedzialne za syntezę antygenów O, H czy Vi bakterii salmonella, mogą być przekazywane w procesie koniugacji, wraz z plazmidem F, bakteriom z rodzaju Escherichia [1].

Więcej >>> Serologiczna identyfikacja Salmonella
Słowniczek i Terminologia
Plazmidy - samodzielne, pozachromosomowe replikony, kodujące takie cechy jak: oporność na antybiotyki i inne leki bakteriobójcze, oporność na jony metali ciężkich, wytwarzanie antybiotyków i bakteriocyn, katabolizm toksycznych związków, zdolność do koniugacji, fermentacji laktozy, pigmentacji i inne właściwości.
Geny umiejscowione na plazmidach mogą również warunkować patogenność bakterii względem człowieka i zwierząt 

Należą do nich, między innym, geny kodujące zdolność patogenu do adhezji do powierzchni odpowiednich komórek u zakażonego gospodarza, penetracji do wnętrza komórki, zdolność do produkcji różnych toksyn, oporność na bakteriobójcze działanie czynników występujących w surowicy i inne. 

Istnieje wiele różnych plazmidów, między innymi: plazmidy typu R (opornościowe), typu F (konigacyjne), plazmidy kolicynowe, degradacyjne i plazmidy wirulencji.
Niektóre plazmidy integrują się z chromosomem bakteryjnym i  ulegają kopiowaniu w tym samym czasie co chromosom gospodarza. Ta zintegrowana forma plazmidu zwanego episomem, może przejść wiele podziałów komórkowych zanim plazmid ponownie oddzieli się od chromosomu. 

 Źródło:

1. POST. MIKROBIOL., 2011, 50, 3, 201–208. Plazmidy i bakteriofagi występujące u Salmonella
2. Etiologia, obraz kliniczny i diagnostyka ostrych zakażeń i zarażeń przewodu pokarmowego oraz zatruć pokarmowych pod red. Marka Jagielskiego. Warszawa 2010

Serologiczna identyfikacja pałeczek Salmonella

Serologicznej identyfikacji mogą być poddawane wyłącznie pałeczki określane na podstawie właściwości biochemicznych jako należące do podgrupy I rodzaju Salmonella (S. enterica subsp. enterica)

Oznaczenie typu serologicznego przeprowadza się w oparciu o diagnostyczny schemat antygenowej budowy wg White’a-Kauffmana-Le Minora.

Bada się serologicznie  izolaty w odczynie aglutynacji szkiełkowej zgodnie z instrukcją serologicznej identyfikacji pałeczek z rodzaju Salmonella dołączoną do zestawu surowic diagnostycznych.

I etap badania to określenie czy szczep aglutynuje z  wieloważną surowicą HM.

Posługując się wieloważnymi surowicami dla grup AO, BO, CO, DO i EO oznaczamy antygeny somatyczne. Wystąpienie aglutynacji w jednej z użytych surowic decyduje o dalszym kierunku badania i toku postępowania celem ustalenia odpowiedniej grupy i podgrupy serologicznej.

Np. po uzyskaniu aglutynacji z surowicą DO wykonujemy odczyn aglutynacji z surowicami cząstkowymi O1, O9, O12, O46. W przypadku ujemnego wyniku z surowicami grupowymi dla grup AO, BO, CO, DO i EO wykonuje się odczyn z surowicą Vi.

Po uzyskaniu dodatnich aglutynacji z surowicami dla cząstkowych antygenów somatycznych właściwych dla danej grupy antygenowej, szukamy antygenów rzęskowych H w fazie I i/lub Fazie II.

Istnieją szczepy nie posiadające antygenu O bądź antygenu H, bądź, któregokolwiek ze składników tych antygenów. (antygen w kwadratowym nawiasie)

Istnieją typy serologiczne całkowicie pozbawione fazy rzęskowej H. np. S. Gallinarum – 1,9,12:-

Istnieją lizogeniczne typy serologiczne, gdzie antygen O może się ujawnić w następstwie konwersji fagowej, gdy dopiero wtedy, gdy hodowla bakteryjna ulegnie lizogenizacji przez odpowiedniego faga. (antygen podkreślony)

S. Montevideo – 6,7,14:g,m [p],s:[1,2,7]

S. Anatum – 3,10 [15] [15,34]:e,h:1,6

W obecnej wersji schematu White’a-Kauffmana-Le Minora zlikwidowano podgrupy C4, E2 i E3, włączone je do grup C1 lub E1, zaniechano również podawania w nawiasie nazw typów serologicznych  powstających w następstwie konwersji fagowej, np. S. Anatum (newington), S. Anatum (minneapolis)

Istnieją typy serologiczne pałeczek Salmonella o takim samym wzorze antygenowym, różniące się jednak biochemicznie.

W grupie O7 (C₁) taki sam wzór antygenowy 6,7:c:1,5 mają Salmonella Paratyphi C, Salmonella Cholerasuis, Salmonella Cholerasuis var. Kunzendorf, Salmonella Cholerasuis var. Decatur, Salmonella Typhisuis.
Udział plazmidów i bakteriofagów w tworzeniu różnorodnych typów serologicznych Salmonella

Płytka Garda 

Płytka Garda- to półpłynne podłoże agarowe z dodatkiem surowicy do aglutynacji szkiełkowej dla antygenu pałeczek rodzaju  Salmonella.

Płytka Garda - zawiera składniki, pozwalające na wytworzenie maksymalnej ilości rzęsek u bakterii Salmonella.

Podłoże umożliwia serologiczną identyfikację antygenów rzęskowych obydwu faz  w szczepach dwufazowych poprzez zahamowanie faz silnie rozwiniętych (Fazy I) i indukowanie słabo eksponowanych faz antygenów rzęskowych (Faza II).  W niektórych szczepach rzęski jednej z faz są tak dominującymi, że uniemożliwiają zajście aglutynacji między rzęskami drugiej z faz i homologiczną dla nich surowicą odpornościową. 

Dla zahamowania mocno rozwiniętej fazy i wyindukowania słabo rozwiniętej fazy, należy do tego podłoża rozpuszczonego, a następnie ostudzonego dodać kilka kropel surowicy, z którą szczep aglutynuje bardzo silnie. 

Uwaga!

Płytki Garda z półpłynnym podłożem nie można suszyć, ani przetrzymywać w lodówce, nie wolno też zamrażać..

Jeżeli, po hamowaniu bakterie nie rozpełzają na płytce należy uznać, że mamy do czynienia ze szczepem jednofazowym. 

Salmonella Enteritidis na podłożu W-B

API Test. Biochemiczny szereg różnicujący S. Enteritidis

UWAGA!
Należy pamiętać, że aglutynację szkiełkową z wieloważną surowicą HM wykonujemy dopiero po sprawdzeniu, czy szczep nie wykazuje autoaglutynacji. W tym celu niewielką ilość masy bakteryjnej z hodowli agarowej rozcieramy na szkiełku podstawowym z kroplą 3% roztworu NaCl aż do uzyskania jednolitej zawiesiny. Poruszając ruchem okrężnym szkiełkiem obserwujemy, czy w zawiesinie pojawiają się strąty, kłaczki, bądź ziarnistości świadczące, że szczep jest autoaglutynacyjny (szorstki). Jeśli, czy zawiesina pozostaje jednolicie mętna, świadczy to, że szczep nie wykazuje  autoaglutynacji (szczep miękki), co oznacza wskazania do dalszego badania serologicznego .